多囊卵巢综合征（PCOS）是女性最常见的卵巢病理，卵巢上神经（SON）的交感神经过度活动在大鼠和人类中诱发 PCOS 症状中起着重要作用。我们之前的研究显示，外科截断 SON 可以逆转疾病进展，促使我们探讨千赫兹频率交流电（KHFAC）调制作为 PCOS 啮齿动物模型中可逆非手术抑制神经活动的方法。56 只动物被随机分配到三个组：对照组（n=18）、PCOS 组（n=15）和 PCOS+KHFAC 组（n=23）。在实验诱导的 PCOS 进展过程中，以及长期 KHFAC 调节治疗 2–3 周期间，评估了卵巢功能的生理、解剖和生化参数。KHFAC 调节能够逆转 PCOS 评估参数的病理变化，即不规则或缺失的发情周期、卵巢囊肿形成、黄体数量减少以及卵巢去甲肾上腺素浓度。PCOS 组和 PCOS+KHFAC 组的生育能力相似，表明 KHFAC 调节方法的安全性。总之，这些结果表明，抑制 SON 活性的 KHFAC 调节方法可能成为 PCOS 及其他病理卵巢疾病的有效治疗方式。
一、引言
多囊卵巢综合征（PCOS）是育龄期最常见的卵巢病理疾病，其特征为高雄激素血症和多囊卵巢表型。PCOS影响高达17%的女性，常伴有内分泌/代谢紊乱。PCOS的主要症状之一是无排卵，导致月经不调和不孕。此外，PCOS患者囊肿分泌的雄激素会导致男性化效应，如痤疮和多毛症。近期研究发现，针灸抑制交感神经活动可减轻PCOS症状。目前PCOS的治疗方法，如雌激素受体调节剂、促性腺激素、腹腔镜卵巢打孔术、减重和运动，主要针对症状而非根本原因，疗效中等。例如，雌激素受体调节剂（如克罗米芬和二甲双胍）和促性腺激素针对激素症状以诱导规律排卵，而腹腔镜卵巢打孔术通过减少组织质量刺激排卵，该手术的成功与否与降低患者雄激素产生的能力直接相关。
展开剩余92%现有的PCOS疗法未考虑人体内脑-卵巢连接的复杂性。事实上，虽然排卵受垂体分泌的促性腺激素（黄体生成素和卵泡刺激素）控制，但也强烈受交感神经调控。哺乳动物卵巢接受来自卵巢神经节以及腹腔和肾丛的节后交感神经密集支配。卵巢通过两条神经接受交感神经支配：（1）卵巢丛神经，与子宫动脉卵巢支相关；（2）上卵巢神经（SON），至少部分与卵巢韧带相关，也称为悬韧带或漏斗骨盆韧带。SON纤维主要支配卵巢的分泌成分，即间质腺和卵泡，而卵巢丛神经纤维主要为血管周围分布。尽管交感神经到达卵巢的方式存在差异，但卵巢内交感神经纤维的分布在所有哺乳动物物种中相似（尽管神经网络的密度在不同物种间差异显著）。去甲肾上腺素是卵巢中存在的主要神经递质。已证明腺体的神经支配参与调节卵巢特异性功能，如类固醇生成和早期卵泡发育，通过激活卵巢卵泡细胞中存在的β-肾上腺素能受体。
SON横断术（携带卵巢内分泌细胞大部分交感神经支配）已被观察到可恢复发情周期和排卵。相反，通过雌二醇给药、慢性交感神经应激或药理学β-肾上腺素能受体激活持续增加交感神经活动，会导致大鼠卵巢出现多囊表型，这在许多方面与女性PCOS相似。
在本研究中，评估了使用千赫兹频率交流电（KHFAC）抑制SON活动作为PCOS潜在治疗方法的效果。KHFAC先前已被证明可在躯体和自主神经中产生有效且可逆的神经传导阻滞。
二、材料与方法
2.1 研究设计
所有动物研究均按照Huntington医学研究所（HMRI）机构动物护理和使用委员会以及智利大学化学与制药科学学院生物伦理委员会批准的动物方案进行。它们还符合国家指南（CONICYT实验动物护理和使用指南）并符合葛兰素史克动物护理、福利和治疗政策。除非另有说明，HMRI和UCh两个地点使用相同的程序和动物方案。雌性Sprague-Dawley大鼠被随机分配到以下三组：
（1）对照组： sesame油皮下注射1 ml/kg，无假手术；
（2）PCOS组：按先前描述的方法诱导PCOS。PCOS在4周龄时通过单次皮下注射戊酸雌二醇（EV，β-雌二醇-17-戊酸酯，Sigma）诱导，超生理剂量为10 mg/kg，溶于1 ml/kg sesame油；注射后7周（即11周龄），动物麻醉后进行手术切除右侧卵巢。在两例动物（均在HMRI地点）中，在切除右侧卵巢的手术期间将袖套电极植入左侧SON；
（3）PCOS + KHFAC组（n = 23）：PCOS在4周龄时通过EV诱导（与PCOS组相同）。注射后7周，动物麻醉后进行手术切除右侧卵巢并在左侧SON植入袖套电极；注射后8周开始，对SON施加KHFAC调节2-3周。
本研究共使用56只动物。这些动物被随机分配到三组：对照组（n = 18，包括HMRI的n = 13和UCh的n = 5）、PCOS组（n = 15，包括HMRI的n = 2和UCh的n = 13）以及PCOS + KHFAC组（n = 23，包括HMRI的n = 3和UCh的n = 20）。在PCOS和PCOS + KHFAC组中，切除右侧卵巢并在28 ± 3日龄时通过单次皮下注射EV诱导PCOS。在PCOS + KHFAC组中，在EV注射和卵巢切除时，将袖套电极慢性植入左侧SON。在HMRI地点，KHFAC调节在77 ± 3日龄时施加，持续21 ± 3天（n = 3）。相比之下，在UCh地点，KHFAC调节在88 ± 2日龄时施加（n = 20），由于动物关注（观察到动物应激水平过高），KHFAC调节提前一周停止，持续15 ± 4天。应激相关症状（如活动水平过高）在动物房每日检查期间通过肉眼观察。一旦发现这些症状，所有动物停止KHFAC调节，应激症状在2-3天内消失。因此，UCh 12只动物的动情周期数据被排除在分析之外。组织学、NE浓度和生育力测试在停止KHFAC调节后至少7天进行，以最小化动物早期急性应激反应的影响，且这些参数不受显著影响。尽管KHFAC调节持续时间存在差异，PCOS + KHFAC组的所有动物均一起分析。
评估了动物的四个主要结局指标：
• 动情周期阶段，通过阴道细胞学每日评估；
• 生育力，在EV注射后第12周评估（仅UCh地点）；
• 卵巢形态表型，在100 ± 10日龄评估；
• 卵巢去甲肾上腺素（NE）浓度，在100 ± 10日龄评估（仅UCh地点的对照组n = 5和PCOS组n = 13，PCOS + KHFAC组的UCh和HMRI地点：UCh n = 8和HMRI n = 2运送至UCh处理）。
2.2 卵巢切除和SON袖套电极植入手术程序
PCOS和PCOS + KHFAC组的动物麻醉以切除右侧卵巢。此外，在PCOS + KHFAC组（以及HMRI地点PCOS组的两个动物）的SON上植入袖套电极。全身麻醉使用氯胺酮/赛拉嗪（90/9 mg/kg，腹腔注射）诱导和维持。剃除头皮和腰椎中段水平侧面皮肤（卵巢上方）的毛发，将动物放置在加热垫上以保持体温。首先在右侧腰椎中段水平进行纵向偏离中线的皮肤切口。解剖下层肌肉，牵开皮肤/肌肉。然后切开腹膜以进入腹腔。拉开脂肪组织直至识别出被可变数量脂肪包围的卵巢。结扎卵巢，切除并保存用于测量NE浓度。使用5-0 PDS可吸收缝线以单连续缝合模式缝合腹膜和肌肉切口。然后使用5-0单丝尼龙连续皮下缝合技术缝合皮肤切口，并涂抹兽医氰基丙烯酸酯胶水以防止动物拆除缝线。
在PCOS + KHFAC组和HMRI地点PCOS组的动物中，在左侧对侧进行第二次纵向偏离中线的皮肤切口。类似地牵开皮肤/肌肉，暴露嵌入SON的上卵巢韧带。将基于硅胶的分裂圆柱双极袖套（内径0.5 mm，外径1.5 mm，长度8 mm，两个外翼，物品号1041.2154.01，CorTec GmbH）放置在韧带上。在袖套周围放置一个或两个7-0聚丙烯缝线以将其固定在韧带上。袖套包含两个纵向间隔的电极（中心距4 mm），由夹在两层硅胶之间的铂箔制成，每个电极由两个激光暴露的50 μm凹陷周向间隔触点组成（边缘间距0.3 mm），通过非暴露的可拉伸蜿蜒金属轨道连接。两个触点的周向长度为0.7 mm，宽度为0.65 mm，暴露电极面积为0.91 mm²。两根导线从袖套纵向引出，由70 μm直径的MP35N/银DFT®导体制成，涂有聚酯酰亚胺（Fort Wayne Metals）。在UCh地点，袖套导线焊接到2针经皮连接器（801-87-002-10-001101，Preci-Dip）。在HMRI地点，袖套导线加铂接地电极焊接到6针经皮连接器（MS363，Plastics One），接地电极皮下放置用于电化学阻抗（EIS）记录。
最后，进行纵向中线头皮切口。从颅骨刮除结缔组织和肌肉。导线和头戴式经皮连接器通过皮下隧道（通过塑料导管）引出至头皮切口。连接器使用兽医氰基丙烯酸酯胶水固定在颅骨上。在连接器周围放置三或四个自攻螺钉（#00-90，不锈钢303，Fillister头，0.0625英寸长度），并应用骨水泥。水泥硬化后，平滑任何可能磨损的不规则处以避免皮肤刺激。将头皮向上拉至连接器周围，使用4-0单丝尼龙缝合。SON袖套上方腹膜、肌肉和皮肤切口的关闭与第一次切口相同。动物在麻醉恢复前给予酮洛芬（2 mg/kg皮下注射）。术后5天在饮用水中添加儿童布洛芬（最终浓度0.2 mg/ml），术后10天在饮用水中添加抗生素复方新诺明（甲氧苄啶-磺胺甲噁唑，30 mg/kg，0.1 mg/ml）。
2.3 电化学阻抗（EIS）评估
在植入后每周从植入的袖套获取电化学阻抗测量。通过将动物放置在锥形塑料套筒（Decapicone，Braintree Scientific，Inc.）中提供约束，套筒带有小鼻孔以允许呼吸，然后在2分钟测试期间用订书钉封闭套筒。使用Autolab恒电位系统（PGSTAT128N配FRA32M模块，Metrohm）在三电极配置中施加±10 mV的正弦交流电位，频率范围为0.1至100 kHz，工作线和对比线连接至袖套电极，参考线连接至铂接地电极。
2.4 SON的KHFAC调节
双极袖套通过头戴式经皮连接器连接到定制的外部可穿戴刺激器（StimAdjuster，Draper Labs），并连接600 mAh锂离子电池。刺激器和电池相互连接并连接至头戴式经皮连接器，然后放置在啮齿动物外套的口袋中，外套由抗撕裂材料（Super K Kote Ripstop）定制制成，带有魔术贴带。外套安装在动物背部，每周更换为清洁外套。KHFAC刺激以双相正弦波形施加至袖套电极，电流幅度为±1.5 mA，频率为50 kHz。刺激连续施加2-3周，每天更换电池以避免耗尽。
2.5 动情周期阶段评估
通过阴道细胞学每日评估周期阶段。使用充满10 μl生理盐水（NaCl 0.9%）的塑料吸管收集阴道分泌物，通过将吸管尖端轻轻插入阴道腔远端开口，同时轻轻约束大鼠。将阴道液置于载玻片上，在光学显微镜下观察。计算上皮细胞（大、圆、有核）、角化细胞（不规则、无核）和白细胞（小、圆）的比例以定义发情前期（P）为排卵日；发情期（E）为排卵后一天；间情期（D）为P前前两天。
2.6 生育力评估
在EV注射后第12周通过辅助交配评估生育力。辅助交配通过将已证明生育能力的雄性大鼠与雌性大鼠一起放置8天（两个完整周期）进行。将雌性加入雄性笼中以防止领地争斗。通过阴道精液栓的存在确认交配成功。然后在成功交配后7天通过（a）发情周期停止和（b）解剖的子宫角和子宫腔中存在胚泡来确定动物生育力。基于UCh在生育力评估和卵巢NE测定方面的经验，这些程序仅在UCh进行。
2.7 卵巢形态表型和卵巢NE浓度评估
在对照组和PCOS组100 ± 10日龄以及PCOS + KHFAC组KHFAC期结束时实施安乐死。使用氯胺酮/赛拉嗪（90/9 mg/kg，腹腔注射）诱导麻醉，解剖卵巢和SON，然后将安乐死溶液（戊巴比妥200 mg/kg，腹腔注射）注入心脏。将卵巢切成两半，一半后固定于4%多聚甲醛用于组织学评估，另一半未固定用于NE浓度评估。固定的卵巢一半包埋于石蜡，使用切片机切成10 μm切片，安装在载玻片上，H&E染色以通过量化黄体和囊肿数量评估慢性卵巢表型。未固定的卵巢一半用0.4N高氯酸匀浆，冻干，使用高效液相色谱（HPLC）评估NE浓度。
2.8 统计分析
统计分析使用Minitab（v 17，Minitab，Inc.）进行。使用单因素方差分析和Dunnett多重比较事后检验计算三组间差异的显著性。对于动物内比较，使用双尾t检验。差异在P < 0.05时被认为显著，在P < 0.01时被认为高度显著。
三、结果
3.1 长期可靠性的电化学阻抗评估
通过EIS在HMRI地点的PCOS和PCOS + KHFAC组五只动物中每周评估袖套与SON接触的长期可靠性。如预期，袖套阻抗在植入后前30-40天逐渐增加，可能是由于袖套周围纤维组织鞘的形成（图1）。在50 kHz测量的阻抗值在所有慢性时间点均保持在6 kOhm以下，表明施加电压低于±9 V（±1.5 mA * 6 kOhm），确保施加脉冲在刺激器的±10 V顺应性范围内。
图1. SON袖套接触长期可靠性的电化学阻抗（EIS）评估（n = 5）。
3.2 动情周期活动
在PCOS和PCOS + KHFAC组中评估动情周期动态。在HMRI接受3周KHFAC调节的三只PCOS + KHFAC动物中，正常动情周期在KHFAC开始后7-17天恢复。为避免可视化HMRI（21 ± 3天）与UCh（15 ± 4天）不同KHFAC持续时间周期动态的挑战，图2仅显示HMRI地点PCOS + KHFAC动物的周期动态。图3显示三个实验组中具有动情周期的动物百分比：对于PCOS组，这表示持续丧失周期；对于PCOS + KHFAC组，这表示在KHFAC调节第二和第三周期间周期的恢复。
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与对照组和PCOS + KHFAC组相比，PCOS组表现出具有动情周期的动物百分比较低（图3）。PCOS组的降低高度显著（P < 0.001，方差分析），而PCOS + KHFAC组未观察到降低，表明KHFAC调节逆转了EV诱导的动情周期抑制。如"材料与方法"部分所述，表现出过度应激水平的PCOS + KHFAC动物被排除在分析之外。
图2. PCOS + KHFAC组的动情周期动态。KHFAC调节开始前周期活动已停止。纵轴上的字母表示动情阶段：发情前期（P）、发情期（E）和间情期（D）。轨迹代表三个个体动物。
图3. 三个实验组中具有动情周期的动物百分比。结果对应于所示动物数量的平均值+标准误。不同字母代表治疗组之间的显著差异（P < 0.01）。
3.3 囊肿和黄体分析
卵巢形态表型定量表明三组间黄体数量不变，PCOS组与对照组和PCOS + KHFAC调节组相比囊肿数量增加（图4）。
图4. 三个实验组卵巢形态表型的动物间比较。结果对应于所示动物数量的平均值+标准误。不同字母代表治疗组之间的显著差异（P < 0.05）。
对PCOS + KHFAC组进行卵巢形态表型的动物内比较，比较EV注射后7周（SON袖套植入手术期间）切除的右侧卵巢与EV注射后11-12周（KHFAC调节期结束后）解剖的左侧卵巢（图5）。PCOS + KHFAC组的23只动物中有12只在图5中进行了评估，因为只有这些动物收集并处理了右侧卵巢用于组织学（左侧卵巢在所有23只动物中收集并处理用于组织学，如图4所示）。动物内比较（KHFAC前后）显示KHFAC调节完成后黄体数量显著增加。
图5. PCOS + KHFAC组12只动物卵巢形态表型的动物内比较。个体值显示为灰线，而组平均值显示为黑线。
3.4 卵巢去甲肾上腺素浓度
在所有三组中评估卵巢NE浓度：对照组-5只动物（均在UCh）、PCOS组-13只动物（均在UCh）和PCOS + KHFAC组-10只动物（UCh 8只，因为UCh其余12只用于生育力评估，HMRI 2只运送至UCh处理）。PCOS组观察到最高的NE水平（336 ± 19 pg/mg卵巢），其次是对照组（232 ± 22 pg/mg卵巢）和PCOS + KHFAC组（71 ± 13 pg/mg卵巢）（图6）。与对照组的事后差异高度显著（P < 0.001），表明EV诱导PCOS开始后NE释放显著升高，以及KHFAC调节后NE释放显著抑制。
图6. 三个实验组卵巢中NE浓度评估（按卵巢重量标准化）。结果对应于所示动物数量的平均值+标准误。不同字母代表治疗组之间的显著差异（P < 0.001）。
3.5 生育力
本研究未评估对照组的生育力；相反，研究人员使用了历史数据，该数据显示20只初产动物在采用与本研究相同程序进行辅助交配后观察到83 ± 3%的妊娠率。在PCOS组13只动物和PCOS + KHFAC组12只动物中评估了生育力（所有动物均来自UCh地点）。PCOS + KHFAC组慢性KHFAC调节的应用未对生育力产生任何有害影响，因为PCOS组（54 ± 14%）和PCOS + KHFAC组（58 ± 15%）的妊娠动物百分比无显著差异（图7）。
图7. PCOS和PCOS + KHFAC组生育力评估，测量为辅助交配后妊娠动物的百分比。结果对应于所示动物数量的平均值+标准误。不同字母代表治疗组之间的显著差异（P < 0.05）。
四、讨论
本研究评估了实验诱导PCOS后以及SON长期KHFAC调节后卵巢功能的几个生理、解剖和生化参数。KHFAC调节能够逆转这些PCOS参数的病理变化，即不规则或缺失的动情周期、卵巢囊肿形成、黄体数量减少、卵巢NE浓度和生育力。本研究的一个局限性是缺乏PCOS + 假KHFAC组，该组动物接受与PCOS + KHFAC组相同的手术植入程序，但不通过植入的袖套电极传递KHFAC调节。虽然拥有这样的组会有所帮助，但研究人员认为，通过评估KHFAC调节前后的生理（图2）和解剖（图5）卵巢功能参数，PCOS + KHFAC组已充分解决了袖套植入的安全性问题。研究的第二个局限性是，与HMRI的3周KHFAC调节相比，UCh在2周后终止KHFAC调节，原因是出现应激相关症状（如活动水平过高）。UCh一旦停止KHFAC调节，应激症状在2-3天内消失。为消除应激反应的任何可能混杂效应，研究人员将12只表现出升高应激症状的动物排除在动情周期分析（图3）之外。然而，这些动物被纳入组织学（图4、5）、NE浓度（图6）和生育力（图7）评估，因为这些测试在停止KHFAC调节后至少7天进行，因此动物早期经历的短暂应激反应不太可能显著影响这些卵巢参数。
哺乳动物卵巢参与介导两种功能：（a）产生性类固醇和（b）卵母细胞成熟至可受精（排卵）。EV PCOS模型产生早期青春期（表现为阴道开口提前）、成年期无排卵状态（表现为缺乏从发情前期到发情期的转变或完全无排卵）、低水平黄体和卵泡囊肿出现。SON手术横断恢复周期性排卵活动，并导致更高数量的黄体和囊肿消失。在本研究中，PCOS + KHFAC组也观察到类似的周期性排卵活动恢复、更高数量的黄体和囊肿消失。正常动情周期的恢复在KHFAC持续7-17天后变得明显，这对应于该物种的2-4个动情周期。
研究人员推测SON活动通过传出神经支配直接影响卵巢功能，尽管它也可能通过激活传入纤维间接影响卵巢功能，以调节下丘脑和垂体循环激素（如促性腺激素）的释放，然后通过改变卵巢动脉血流影响卵巢。SON活动的KHFAC抑制不排除这些潜在机制中的任何一种，因为传入和传出纤维的活动都可能被抑制。然而，KHFAC后卵巢NE释放的降低支持高NE浓度在大鼠PCOS表型诱导中的作用，并证实了研究人员早期研究的结果，显示EV诱导或慢性应激暴露诱导的PCOS表型中卵巢NE浓度升高。本研究未明确评估SON活动抑制的完全性，然而，卵巢NE浓度79%的降低表明SON活动（至少其传出纤维）的抑制程度相当显著。
最后，慢性KHFAC调节的应用已被证明是安全的，证据是先前接受KHFAC的动物与未接受慢性神经刺激的PCOS动物相比具有相似的生育力。总之，所呈现的结果表明SON的KHFAC调节可用于PCOS以及潜在其他病理性卵巢疾病的生物电子治疗。此类生物电子药物可通过以时间和剂量依赖性方式精确检测和调节神经信号，为每位PCOS患者量身定制。
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